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而激进尊攘派中最大的集团长州藩则正策划着更为危险的举动，他们打算从内部扰乱进而占领京都，挟制天皇，让天皇下诏讨伐江户幕府——这一行动被称为“夺玉”，“玉”指的就是当时在位的孝明天皇。
次年是元治元年（1864年），六月五日，负责京都治安的新选组逮捕了一名化装成武具商的尊攘志士古高俊太郎，俊太郎受刑不过，供出当晚将有长州、土佐、肥后等脱藩志士二十余人聚集在京都三条河原町的旅馆池田屋开会，打算在京都纵火，然后趁乱攻入皇宫，夺取天皇。于是新选组在通报了京都守护职松平容保以后，快速展开行动，乘夜奇袭了池田屋，包括宫部鼎藏、吉田稔麿在内的七名志士被当场斩杀，其余数人被逮捕——桂小五郎倒是侥幸逃得一命，被迫化装成乞丐逃出京都。
“池田屋事变”，可以说是日本维新史上的一个重要转折点，长州藩从此作为倒幕的急先锋稳稳站在历史的舞台上。
新选组悲歌
“新选组”也写作“新撰组”，是在文久三年（1863年）四月正式成立的。
且说会津藩主松平容保在前一年（1862年）的闰八月就任京都守护职，负责京都的治安，为了增强警备力量，他经过幕府的同意，授命鹈殿长锐、清川八郎、佐佐木只三郎等人招募浪人，组建了“浪士队”。但因为浪士队内部品流复杂，大量攘夷志士也蜂拥而入，使得容保等人害怕这支队伍无法维持京都治安，反而变成动乱之源，于是在文久三年（1863年）年初将其取缔，主力调往江户，编成“新征组”。
浪士队被取缔后，队员芹泽鸭、近藤勇等人前往求见松平容保，陈述了自己对幕府的赤胆忠心，容保深受感动，就允许二人创建新选组。新选组设立之初由三驾马车共同指挥，也即上面提到过的芹泽鸭和近藤勇，还有一位新见锦。然而到了当年的九月，内部纷争暴起，首先是新见锦被勒令自杀，随即芹泽鸭在与情人幽会岛原料亭的时候，被近藤一党的土方岁三、山南敬助、冲田总司等人刺杀。
从此近藤勇成为新选组的唯一首脑——局长，实际主导队务的则是副长，人称“智囊”的土方岁三。近藤勇出自武藏多摩地区，本是小剑术流派“天然理心流”第三代近藤周作的养子，后来继承为第四代传人，新选组内很多成员也都是他的同门。
当初德川家康建都江户时，为防一旦有变，可以使后代将军安全撤至甲府，因此采纳了大久保长安的建议，在多摩八王子地方布下一哨人马，这哨人马由原住民五百人，加上武田遗臣五百人组成，称为“八王子千人队”。传说新选组中坚力量大多是八王子千人队的后裔，因此对德川幕府秉持着强烈的忠义之心——六番组长井上源三郎已被证实确为这种身份。
新选组创建以后，即在京都各町巡逻，一开始的目的是捕拿妄图闹事的宵小，但因为很多尊攘志士都想在京都掀起纷乱，以便混水摸鱼地夺“玉”，所以很快的，新选组就成为了尊攘派的死敌。元治元年（1864年）六月五日，发生了“池田屋之变”，新选组随之名声大噪。
新选组对内管理严格，法度森严，对外则行动迅速，血腥无情，在他们的管理下，京都治安略有好转。然而随着德川幕府的垮台，新选组也日趋走向没落。在倒幕维新的戊辰战争中的每一仗，几乎都可以看到新选组成员的身影：先是伏见·鸟羽之战，江户无血开城后还有上野之战、会津之战和最后的箱馆之战。最终在新政府军攻打五稜郭的时候，人称“鬼副长”的土方岁三中弹身亡，标志着新选组的彻底覆灭。
除土方岁三外，新选组的其他重要成员的下场是：近藤勇曾在关东地区组建甲阳镇抚队与新政府军对抗，战败后被处以斩刑；一番队长、剑术高手冲田总司在戊辰战争爆发后不久就因肺结核而死；参谋伊东甲子太郎和五番队长武田观柳斋等人在内部斗争中被整肃；总长山南敬助和八番队长藤堂平助等人脱队后遭到斩杀或被勒令切腹。
只有二番队长永仓新八和三番队长斋藤一侥幸活了下来。永仓新八在戊辰战争前就脱队而去，自组“靖兵队”与新政府军对战，会津战争后被赦免，恢复了松前藩籍。斋藤一曾在会津城下代替土方岁三指挥战斗，兵败后遭到流放，战争结束后，他改名藤田五郎，进入警视局，退役后就任女子高等师范学校的校工，直到病殁。
●禁门之变
元治元年（1864年）六月五日爆发的“池田屋事变”，使得长州激进尊攘派的活动从地下转入地上，毛利家三名尊攘派的家老——益田右卫门介、福原越后和国司信浓——在中下级武士的煽动下，决定指挥兵马进京，对“八月十八日的政变”提出申诉。这种轻率的举动受到了高杉晋作、久坂玄瑞等稳健派的反对，然而他们的努力劝说最终化成了泡影，长州军还是出动了，将领除三家老外，还包括“游击队”队长来岛又兵卫，以及被迫从征的久坂玄瑞等人。
长州藩最初的藩论是倾向于锁国佐幕的，就在“樱田门外之变”前后，长州藩内制定了三条基本纲领，那就是：一，尊王；二，佐幕；三，恪守藩祖（毛利辉元）以来的忠义之心。然而重臣长井雅乐却跳出来大唱反调，向藩主毛利敬亲提出了《航海远略策》，指出毁约攘夷是没有好结果的，只有公武一心，开国进取，才能挽救艰危的时局。长井思想的基调，对内是公武合体，对外是开国，在得到毛利敬亲的首肯后，他前往江户说服了老中安藤信正和久世广周，又进京说服了天皇和许多公卿，为把公武两家拉上同一辆战车而费尽了心机。
然而长井雅乐的“航海远略论”却遭到长州藩内尊攘派的激烈反对，以松阴门下弟子桂小五郎和久坂玄瑞等人为首，纷纷提出必须“先攘夷，后开国”，想在不先解决内部矛盾、改革政治以前就向西方列强敞开大门，根本就是开门揖盗。曾经支持过吉田松阴的重臣周布政之助也站在小五郎等人一边，于是众人齐心协力把长井雅乐赶下了台。
长井雅乐在文久三年（1863年）二月切腹自杀，从此长州藩论全面转向尊王攘夷，并最终发动兵马上洛，酿成了血腥的“禁门之变”。
且说长州军总计三千人，分海陆两道杀往大坂，随即以伏见的长州藩邸为据点，大举向京都进发。当时守卫京都的是包括萨摩、会津在内的共三十个藩的部队，就兵力来说，长州军完全落在下风。然而被热血冲昏了头脑的长州激进尊攘派却根本看不清形势，在他们想来，只要通过公卿上奏天皇，说明自己的尊攘大义，则天皇自然会站到自己一边，到了那个时候，萨摩、会津等藩的武士，难道还敢违逆天皇的旨意吗？
然而事实上当时的孝明天皇并无从幕府手中收归权力的野心，同时因为去年几场失败的攘夷战争，也已经很明确地表过态：“征服丑夷乃国家之大典……无谋之攘夷实不为朕之所望……”所以天皇是根本不会主动走出皇宫，接纳长州志士们的所谓忠心的。
皇宫四周布列着各藩军队，而长州军则分扎在嵯峨天龙寺、山崎天王山和伏见三处，与各藩遥遥相对。六月二十七日，松平容保命令各藩部队加强皇宫各门的警备，勿使长州一人一骑进入。七月三日，他又写信给福原越后，要求长州军尽快撤出京都附近地区，否则后果自负。
长州军不甘心就此退出洛中，可是面对数倍于己的兵力，也不敢贸然发动攻击。就这样，随着时间的流逝，形势对幕府方越来越有利，七月十八日夜晚，松平容保终于请到了幕府讨伐长州的敕命，随即带病出阵，指挥各藩军队向长州军发起猛攻。
长州军得到消息后，骑虎难下，被迫分道杀向皇宫，激烈的战斗就这样打响了。山崎方面屯扎着长州军的主力，主要将领有久坂玄瑞、益田右卫门介、真木和泉等人，首先遭到诸藩联军的进攻，被迫向后退却。为了掩护主力部队，同时扭转战场形势，另外两路长州军大踏步地向皇宫挺进，先锋来岛又兵卫亲率两百名部下直冲向蛤御门。
当时守备蛤御门的乃是八百名会津藩兵，看到长州军汹涌杀来，匆忙奋起迎战，双方就此在御门前展开了激斗。作为天龙寺方面主将的国司信浓紧跟在来岛又兵卫之后加入战团，高呼“杀败会奸，冲进皇宫去求见天皇陛下”等口号拼死奋战，会津军力不能敌，节节败退，眼看御门就要被长州军攻破了。
然而就在这个时候，一直驻扎在附近、守护乾御门的萨摩岛津军却开始行动了。岛津方主将正是前几年投海不死的西乡吉之助隆盛，在他的指挥下，两百余名萨摩藩兵救援蛤御门，奇Qīsuū。сom书突然出现在长州军的背后。遭到前后夹击的长州军瞬间崩溃，素有“鬼来岛”之称的勇士来岛又兵卫身中铳弹，自度不得幸免，于是含恨切腹而死。
就这样，长州军最后一线转败为胜的希望就此破灭，三路军队陆续都被击溃。久坂玄瑞被迫闯入公卿鹰司邸，想要负隅顽抗，结果被萨摩、会津、桑名等藩兵团团围住。恶战一场后，玄瑞和好友寺岛忠三郎一起含泪对刺而死。
最后毙命的长州军大将是真木和泉，他依靠天王山地势之险，一直固守到八月二十一日，掩护三位家老顺利撤退，然后也被迫自尽了。这就是著名的“蛤御门之变”，也称“禁门之变”，长州藩第一次明确地打出尊王倒幕的旗帜，但因为准备不够充分，敌我力量对比过于悬殊，最终以全面溃败而告终。据说经此一战，长州藩尊攘志士战死达三百余人，藩中舆论为之大变。
●功山寺起义
“禁门之变”爆发后，幕府传令各地诸侯，以前尾张藩主德川庆胜为总督，越前藩主松平茂昭为副将，联军讨伐长州。然而此时幕府权威已堕，诸侯各抱观望之心，都不肯使出全力，担任讨伐